位于瓦尔德希布伦大学医院的瓦尔德希布伦临床实验室，集中对国际大都市巴塞罗那120万人口的医院活动和初级保健进行体外诊断研究。这种强烈的活动使我们能够对体外诊断的各个方面保持非常广泛的看法，包括临床微生物学。我将依靠这项活动，以及它所带来的经验，来回答标题中提出的问题，即新一代大规模测序技术(NGS)在临床微生物学中的应用是真实的还是虚构的，我将用我们自己在丙型肝炎研究中的经验来举例说明。
自1990年以来，我们中心的研究人员一直在研究这种病理学，几乎是在1989年确定其病原体丙型肝炎病毒(HCV)后立即进行的。为了说明我们的护理活动的规模，我们每年进行约70,000次HCV血清学研究，其中10%为阳性，并进行约7,000次病毒载量研究，其中45%具有可检测的病毒RNA水平。此外，我们每年还通过NGS进行1000多项HCV亚型分型研究，我们通常称之为“高分辨率丙型肝炎病毒亚型分型”。正如我稍后将讨论的，这是开始治疗感染所必需的。到目前为止，我们医院已经治疗了1000多名病人。
介绍丙型肝炎病毒感染
病毒性肝炎是一个主要的全球卫生问题。全世界约有5亿人感染了导致这些感染的五种病毒(病毒A、B、C、D和E)中的一种。尤其相关的是B (HBV)和HCV病毒，分别有2.5亿和1亿人感染。这五种病毒表现出不同的传播途径(肠内或肠外)和病毒学特征(例如，它们属于不同的科，或者它们的基因组可能是RNA或DNA)。然而，为了研究其具有重要临床意义的基因组特征，我们考虑了相同的参数:系统发育分类以确定其基因型/亚型，量化与治疗失败相关的可能变异的存在和比例，以及辨别可能的传播的研究。所有这些可能的研究都可以利用完全类似的技术。
事实上，这种相似性在临床微生物学研究中是理想的，因为护理活动的强度和需要尽快获得这些决定的响应，例如决定治疗策略。这正是我们稍后将详细介绍的HCV的情况。在这一点上，我们必须考虑到这些试剂(准种)的病毒种群的巨大变异性和复杂性，这需要通过克隆测序进行种群研究。这一事实本身似乎已经证明了NGS技术的应用是合理的，因为它们允许在同一样本中获得数千个传染性病原体基因组的克隆序列，而不是Sanger直接测序，后者提供了群体的平均(一致)序列。
为了了解丙型肝炎病毒感染的影响，世界卫生组织截至2017年7月发布的最新数据表明，约有7000万患者患有慢性感染，每年有近40万人死亡。只有15-45%的急性感染(例如，受IL28b基因型影响)，病毒会自动消除。在其余55-85%的患者中，感染变为慢性感染，感染20年后有15-30%的风险进展为肝硬化，2-7%的风险进展为肝细胞癌。这种感染具有大流行的特征，在欧洲的流行率为1.5-2.3%(在西班牙，最近的初步研究表明为1.1%)，但在埃及或巴基斯坦等一些地区的流行率更高。
HCV是一种包膜病毒，属于黄病毒科。它包含一个长度为9.9 kb的单链RNA基因组，编码一种蛋白质，一旦翻译，就会进行蛋白质水解处理，以提供病毒的不同结构和非结构成分。从n端到C端，其结构成分为:E1和E2(包膜成分)、C(核心，病毒衣壳成分)，其次是病毒的非结构或功能成分p7(离子通道)、NS2(自身蛋白酶)、NS3(解旋丝氨酸蛋白酶)、NS4 (NS3辅助因子)、NS5A(复制调节磷酸化蛋白)、NS5B(聚合酶:RNA依赖性RNA聚合酶)。NS3、NS5A和NS5B蛋白是目前用于治疗这种感染的直接作用抗病毒药物(DAA)的治疗靶点。病毒与相关的脂蛋白一起传播，并以诱导的膜状网在细胞质中复制。因此，不像其他病原体，如乙型肝炎病毒(HBV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)， HCV没有核库。
由于缺乏病毒聚合酶的纠错能力(1.5 × 10-3个取代/碱基/复制周期)，HCV具有非常高的突变率。这样，在每个复制周期中产生多达6个突变，导致所有新的病毒基因组与之前的基因组不同。因此，感染患者的病毒群将由一个非常复杂的混合物组成，这些混合物由不同但相关的基因组组成，称为“准物种”。构成准种的病毒种群因复制过程中突变产生的氨基酸多态性而不同，随后根据其对病毒适应性(复制能力)的影响进行选择。在这些多态性中，我们可能会发现一些对抗病毒治疗的易感性降低，如DAA，我们称之为抗性相关替代(RAS)。这些基因通常存在于少数群体中，其“适应度”低于野生型或主要变异。当给予DAA时，这些易感性降低的变异被积极选择，导致病毒耐药性，即治疗失败。
我们说，持续病毒学应答(SVR12/SVR24)发生在治疗结束后12/24周内血浆病毒RNA水平未检测到(通过超灵敏实时PCR <15 IU / mL)。在丙型肝炎病毒感染的情况下，通常认为这意味着丙型肝炎病毒感染已被成功治愈。然而，这种情况在大型病毒感染中是例外的，例如HBV或HIV，其中无法检测到的病毒基因组水平(病毒学反应)仅表明病毒活性受到抑制，而不一定能从感染中治愈。
在引入DAA后，丙型肝炎的护理标准正在迅速改变。这些药物是NS3蛋白酶(后缀-previr)、调节蛋白NS5A(后缀-asvir)和NS5B聚合酶(后缀-buvir)的抑制剂。在很短的治疗时间内(通常为12周，甚至8周)，治愈率达到95%以上。虽然DAA的生产成本很低，但这些药物仍然很昂贵(15000欧元/12周)，这限制了它们的普遍应用。尽管丙型肝炎病毒治疗的可及性正在改善，但仍然有限。到2015年，在全世界7100万丙型肝炎病毒感染者中，20%(1400万)知道自己的诊断，其中只有7.4%(110万)在2015年之前开始治疗。在西班牙，估计有30万人患有慢性丙型肝炎病毒感染，其中只有40%被诊断出来。其中约7万人已得到治疗，治疗覆盖率接近40%，远高于世界平均水平。
NGS技术在丙型肝炎病毒感染研究中的应用:明显优于传统技术
尽管DAA治疗非常有效(在西班牙平均SVR为95%)，但治疗失败的患者数量不容忽视。这些患者必须根据HCV基因型/亚型进行正确分类，并且有必要在他们中检测可能的耐药变异(RAS)，以告知新的治疗策略，至少在一些特定区域，如NS5A，正如国际指南(EASL)所指出的那样:“易于获得可靠的测试来评估HCV对NS5A抑制剂(跨越氨基酸24至93)的耐药性的医生可以使用这些结果来指导他们的决策”。
这激发了通过克隆群体测序方法(如NGS)对这些变异进行研究。从这个意义上讲，同样的国际指南指出，该测试“应基于将RASs报告为‘存在’或‘不存在’的群体测序(‘Sanger’)，或基于临界值为15%的深度测序(NGS)(必须考虑在生成的序列中存在超过15%的RASs)”。然而，没有明确的证据支持这15%的比例，这是JP Pawlotsky先前建议的。在这方面，Sarrazin等人在接受DAA治疗并通过NGS分析的1000例样本中报告，基线RAS水平为1%的患者的SVR12为93.3%，基线RAS超过15%的患者的SVR12为88.2%。然而，在没有基线RAS的患者中，他们报告的SVR12为98.4%。这表明RAS在比例<15%的情况下会影响SVR(至少差5%)，而如此低的比例只能通过NGS检测到。
EASL指南中指出的群体测序(“Sanger”)的潜在用途似乎仅仅是基于将15%作为直接测序的灵敏度极限。在这里，我们应该记住，群体测序不是一种定量方法，最低水平的检测高度依赖于观察者。相比之下，NGS(或深度测序)是定量的。尽管15%的“临界值”来自专家建议，但我们应该记住，“医学必须以证据为基础，而不是以卓越为基础”。
考虑到病毒基因型影响SVR，为了优化治疗成功并避免RAS选择的治疗失败，HCV基因型/亚型应正确确定，如EASL等国际指南所示:“HCV基因型和基因型1亚型(1a或1b)必须在治疗开始前进行评估，并将决定治疗的选择”。从这个意义上说，市场上可用的基因分型技术存在很大的错误率，而病毒基因组NS5B区域的NGS似乎没有这些错误。
事实上，在我们的中心，NGS每年进行近1000次病毒基因型/亚型研究，经过1000多次治疗，SVR为98.4%，比西班牙的平均水平高3%。显然，这些数据支持NGS技术用于基因分型和耐药变异分析研究的适用性。但是，它们也适合我们的日常工作吗?在我们的实验室，我们开发了NGS协议，用于优化和自动化最初复杂的过程，包括创建扩增子库、纯化、滴定等。
我们的NGS程序最初是在454平台(罗氏)上与Vall d 'Hebron研究所和罗氏公司合作开发的“超深焦磷酸测序”方法(UDPS)。然而，在454平台停产后，这些方法很容易适应“合成测序”方法(SBS MiSeq-Illumina)。病毒基因组的自动提取，以及通用分子适配器的使用，以及在预加载板中结合分子标识符，所有这些都通过机器人系统，使我们能够将这项技术应用于护理任务。我们最近报告了我们在1400多个HCV亚型临床试验中的经验。
该方法是基于NS5B区域片段的计算机系统发育分析，推荐用于HCV分类。此外，它目前支持迄今为止识别的所有67种HCV亚型的特征，非常容易地允许将任何未来的发现纳入其中，例如在我们自己的实验室发现的基因1型的新亚型。这种技术的敏感性和定量性质使我们能够检测亚型的混合物并量化它们的相对比例。使用任何其他方法，这些任务将是具有挑战性的，甚至在后一种情况下是不可能的。
另一方面，我们的NGS程序虽然适用于护理研究，但仍然需要一定程度的复杂性，这在许多实验室是不可行的。出于这个原因，我们最近验证了一个基于罗氏Cobas 4800分析仪的新的实时系统。该方法在进行基因型1a/1b分型以及其他基因型(显然不是亚型)时表现良好，只有4%的未确定病例需要进行测序处理。DAA治疗的不断发展预示着泛型治疗的出现，因此没有必要进行基因型/亚型评估。然而，就目前可用的一些DAA而言，此前已经发表过同样的声明，经验表明，正如国际指南所承认的那样，不同基因型之间的SVR仍然不同。
RAS研究是最近纳入我们的护理活动(今年只有150项护理研究，尽管有300多项处于研究和开发阶段)，其基础是对覆盖治疗靶区(NS3, NS5A和NS5B)的四种扩增子的分析。它的处理过程实际上与亚型研究相匹配，尽管每个患者包含更多的扩增子。为了优化这些类型的研究，并避免由于扩增过程造成的偏差，我们使用了亚型特异性引物，以便在RAS研究之前确定HCV亚型。我们处理的大多数样本来自加泰罗尼亚其他地区或西班牙其他地区的其他中心，在那里我们使用传统技术进行基因分型。有了这些信息，我们已经能够确认我们之前的结果，关于这些传统技术获得的高错误率(bbb10 %)。我们的RAS护理研究数据也证实，大多数治疗失败与NS5A区域的变异有关，在72%的病例中发现了NS5A区域的变异，其次是NS3区域的变异，在52%的病例中发现了NS3区域的变异。此外，由于治疗通常依赖于DAA的组合，36%的失败出现在多个区域的联合RAS。
这些NGS技术的进一步应用可能是研究患者之间的感染传播，如医院感染的情况。在此应用中，对可能的源患者和受体获得的准种进行简单的比对和系统发育研究，可以通过观察共同的单倍型，更确定地推断感染的共同起源。
总之，我们在HCV感染临床研究中的经验使我们能够断言NGS技术在临床微生物学中的巨大用途，因为我们将其纳入的三种应用中的任何一种都完全适用于所有其他病原体。
可根据要求提供参考资料。
弗朗西斯科·罗德里格斯·弗里亚斯博士是临床微生物学会议作为MEDLAB Europe的一部分于2017年9月15日在西班牙巴塞罗那举行。
