间接免疫荧光(IIF)具有较高的敏感性和特异性以及广泛的抗原谱，是一种重要的实验室诊断筛选方法。然而，荧光模式的显微评价是耗时和具有挑战性的实验室工作人员。如今，许多实验室使用自动化系统来促进和标准化IIF读数和解释。自动化显微镜系统能够快速数字获取免疫荧光图像，以及可靠的结果评估，包括阳性和阴性样本的区分，关键自身抗体的模式分类和滴度指定。新的最先进的系统结合了基于深度学习方法的人工智能(AI)，用于分类免疫荧光模式和计算抗体滴度。活体显微镜的出现，使评估完全在屏幕上进行，为IIF诊断提供了一个新的速度和便利水平，以及显微镜和操作员之间的高度标准化。自动IIF结果解释特别适用于自身免疫血清学应用，如检测人上皮细胞(HEp-2)上的抗核抗体(ANA)，粒细胞上的抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)，或露西Crithidia luciliae上的抗双链DNA (dsDNA)抗体。
安娜
ANA是许多自身免疫性疾病的关键诊断标准，尤其是风湿性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、混合性结缔组织病、Sjögren’s综合征、系统性硬化症和多发性/皮肌炎。测定ANA的金标准是HEp-2细胞上的IIF。这种底物提供了完整的抗原谱，并允许对超过100种不同的自身抗体进行研究。IIF阳性结果可通过ELISA、化学发光免疫测定(ChLIA)、免疫印迹或IIF微点测定等单特异性试验确认。
识别HEp-2细胞上的荧光模式可以对患者样本中存在的抗体进行分类。国际抗核抗体(ANA)模式共识(ICAP, www.anapatterns.org)已经开发了一个模式分类树，每个模式都分配了一个抗细胞(AC)代码编号，以协调实验室之间的报告。
使用计算机辅助显微镜系统可以简化和标准化HEp-2细胞ANA的评估，其中基于人工智能的系统可提供最高的熟练度。例如，EUROPattern系统使用深度卷积神经网络提供高度可靠的ANA阳性和阴性结果的区分，以及根据ICAP识别9种ANA模式，即均质(AC-1)、斑点(AC-4, 5 29)、密集细斑点(AC-2)、核核(AC-8, 9, 10)、核点(AC-6, 7)、着丝粒(AC-3)、核膜(AC-11, 12)、抗线粒体抗体(AMA, AC-21)和细胞质(AC-15至23)。深度学习算法确保高效分割HEp-2细胞，即检测它们的位置和形状，因此不再需要对细胞进行反染色。界面细胞和有丝分裂细胞都得到了可靠的鉴定。自动分类器生成具有置信度值的模式和效价建议，包括混合模式，即样品中存在多个抗体。对于每一种模式，从孵育稀释的荧光强度自动计算滴度，确保可重复的结果。
为了研究自动化程序的诊断准确性，使用EUROPattern分类器的IIF评估与使用213例患者血清的常规目视判读进行了比较。对正面/负面歧视的总体同意率为93.0%。在模式分配中，不同核模式的一致性为90.1% ~ 100%，细胞质模式的一致性为85.4% ~ 99.5%。
Anti-dsDNA抗体
抗dsdna抗体是SLE的一个标志，是诊断的重要标准。在不同的研究中，它们在SLE中的患病率从20%到90%不等，这取决于所使用的测试方法和疾病活动性。与金标准法尔试验一样，使用Crithidia luciliae作为底物(CLIFT)的IIF被认为具有非常高的疾病特异性。该方法利用了Crithidia luciliae的着丝体，它富含DNA，但几乎不含任何其他抗原，因此能够高选择性地检测抗dsdna抗体。与手动读取相比，荧光信号的自动评估增加了结果的可靠性，手动读取是主观的，并导致实验室内部和实验室间的高度差异。
CLIFT的解释被纳入了EUROPattern系统。复杂的软件能够识别原生动物的细胞器，并评估特定的着丝体荧光，而不仅仅是暗光分类，确保结果的高可靠性。结果根据着丝体荧光分为阳性或阴性，并包括基于阳性样品荧光强度的滴度指定。用83种血清对赤虱IIF进行了自动评价和目测评价，两种方法的符合率为97.6%。
ANCA
ANCA是诊断和鉴别自身免疫性脉管炎的重要血清学标志物，特别是以抗蛋白酶3自身抗体(PR3)为特征的肉芽肿病伴多血管炎(GPA，学名Wegener 's肉芽肿病)和以抗髓过氧化物酶自身抗体(MPO)为特征的显微多血管炎(MPA)。此外，ANCA可在慢性炎症性肠病中发现。ANCA由IIF检测，并使用单特异性测定进行确认。
IIF底物乙醇固定和福尔马林固定的粒细胞被用于识别抗pr3(细胞质，cANCA)和抗mpo(核周，pANCA)抗体的典型ANCA染色模式。另外一种由包有粒细胞的HEp-2细胞组成的底物可以立即区分ANCA和ANA。EUROPattern系统集成了ANCA的自动阳性/阴性识别，以及pANCA, cANCA和非典型ANCA (DNA-ANCA, xANCA)的模式识别。后者可由针对乳铁蛋白或其他抗原的抗体产生。给出了具有置信值的估计滴度。
使用EUROPattern对ANCA进行计算机辅助评估，并与使用由乙醇固定颗粒细胞和福尔马林固定颗粒细胞组成的BIOCHIP马赛克培养的170份血清进行人工评估进行比较。结果的总体一致性为98.2%。对于模式分配，96.5%的cANCA, 94.7%的pANCA和91.8%的非典型ANCA是一致的。
进一步的自身抗体
在组织底物上测定自身抗体有助于诊断一系列自身免疫性疾病。例如，以大鼠肝脏和大鼠肾脏为底物，对自身免疫性肝病中的自身抗体进行研究，支持了1、2型自身免疫性肝炎和原发性胆管炎的诊断和鉴别。这两种底物上的免疫荧光信号可以用EUROPattern系统自动评估。评估包括相关ANA(大鼠肝脏)和AMA(大鼠肾脏)的阳性-阴性分类，以及使用这两种底物进行相互确认的抗肝肾微粒体(LKM)模式的鉴定。组织底物的自动评估和视觉评估的一致性在ANA和LKM大鼠肝脏上分别为96.5%和98.6%，在AMA和LKM大鼠肾脏上分别为94.6%和98.9%。
自动图像采集的组织基质，如猴子肝脏，猴子胃和猴子食道，以及细胞为基础的分析也可用。
实时和自动显微检查
屏幕显微镜通过允许直接在计算机屏幕上记录和查看IIF图像，从而消除了对黑暗室的需要，极大地简化了IIF评估。新的EUROPattern显微镜Live(图1)结合EUROLabOffice 4.0软件(图2)，特别是，提供了最先进的实时显微镜和全自动荧光图像采集。新型的自动激光聚焦能够在两秒内对每张图像进行快速图像采集和分类。这些图像通过高分辨率相机记录下来，生成高分辨率图片。该显微镜包括一个自我校准的长寿命荧光LED，提供恒定的照明，确保即使在不同位置的显微镜之间的标准化质量。对于活体显微镜，显示器的多点触控屏幕可以方便地导航和缩放。团队协商可以在不需要讨论桥梁的情况下进行。
图1:EUROPattern显微镜Live
EUROLabOffice 4.0软件分类荧光模式和指定滴度如上所述。它在LIS、自动处理器和显微镜之间持续通信，确保快速、安全、可跟踪的数据交换。其完整的网络集成意味着IIF结果可以与ELISA、免疫印迹或ChLIA等其他分析方法的结果合并，以生成详细和可靠的患者报告。所有信息都清晰地显示在结果窗口中。来自不同血清稀释剂和底物的结果被合并到每个患者的一份报告中，新的结果与患者的病史进行比较。可分批确认阴性样品，提高效率。所有数据、结果和图像都被存档，而不需要纸质记录。
图2:使用EUROPattern进行ANA评估的示例
视角
计算机辅助评估提供了自身免疫诊断中IIF结果的标准化和巩固。具有协调软件和硬件的自动化平台减少了实验室技术人员的工作量，并提供更客观的评估。从手工显微镜到完整的屏幕上评估的进步导致了IIF诊断的前所未有的便利性和效率。此外，结合深度学习过程的软件可以提供准确的阳性/阴性分类、模式识别和滴度指定，质量相当于或优于视觉显微镜。使用神经网络进行模式评估的进一步应用程序将很快被添加到曲目中。
这篇文章发表在最新一期的Omnia健康杂志上。今天在网上阅读全文。
